Rac1/cdc42活性磁珠拉下实验

Rac1/Cdc42活化磁珠下拉测定法（目录编号17-10394）提供了一种检测细胞裂解物中Rac和Cdc42活性的有效方法。 该测定法使用Rac/Cdc42的下游效应子p21激活的蛋白激酶（PAK1）从样品中分离Rac/Cdc42的活性GTP结合形式。 PAK1的p21结合域（PBD）表示为GST融合蛋白，并与磁珠偶联。 磁力架分离后，进行免疫印迹，并用特异性单克隆抗体检测活化的Rac/Cdc42，然后用HRP偶联的二抗和ECL试剂检测。

研究类别
细胞信号传导

信号传导

物种交叉反应性： 人和小鼠。预测与所有哺乳动物物种发生交叉反应。
抗-Rac1，克隆23A8：物种交叉反应性：人类，小鼠和大鼠。其他物种交叉反应性未知。
抗-cdc42 物种交叉反应性： 人，小鼠，大鼠和狗。 其他物种交叉反应性未知。

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通过从已加载GTPγS的3T3/A31和HeLa细胞裂解物中沉淀Rac1-GTP和cdc42-GTP进行常规评估（裂解物在体外用GTPγS加载cdc42-GTP）。 使用抗Rac1（1 μg/mL）通过免疫印迹分析检测沉淀的Rac1-GTP和cdc42-GTP。

Rac1/cdc42检测试剂（Pak-1PBD，磁珠）：在150uL谷胱甘肽磁珠中的300ug Pak-1 PBD，以含有50%甘油的PBS中的50%磁珠浆液提供，最终体积为300uL。

抗-Rac1，克隆23A8：一个小瓶，含有250μg纯化IgG2akappa，溶于250μL储存缓冲液（0.1 M Tris-甘氨酸（pH 7.4），0.15 M NaCl，含有0.05%叠氮化钠）中。

抗Cdc42，小鼠单克隆IgG1：一个小瓶，含有50 ug纯化小鼠IgG1，溶于200 uL的10 mM磷酸钠（pH 7.5）、75 mM NaCl、0.75 mM叠氮化钠、0.5 mg/mL BSA和50%甘油中。

Mg2+裂解/洗涤缓冲液，5X，目录号20-168：两个小瓶，每瓶包含18 mL的5X MLB：125 mM HEPES、pH 7.5、750 mM NaCl、5%Igepal CA-630、50 mM MgCl₂、5 mM EDTA和10%甘油。

100X GTPγS，10 mM，目录号20-176：一个小瓶，包含50 μL的10 mM GTPγS，100X储备液，溶于50 mM Tris-HCl，pH 7.8，GTP的不可水解类似物中。 足以标记5 mL细胞裂解物。

100X GDP，100mM，目录号20-177：一个小瓶，含有50 μL 100 mM GDP、100X储备液，溶于50 mM Tris-HCl、pH值7.8中。 GDP（鸟苷5′-二磷酸）用于体外标记非活性形式的G蛋白。 足以标记5ml细胞裂解物。

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